На выбранных таким образом колонках выполняют пробный анализ и при необходимости вносят изменения в систему колонок для оптимизации разделения. Оптимизацию приходится проводить, если колонки не обеспечивают требуемого диапазона разделения или эффективности разделения.

Наиболее сложным является выбор системы колонок для разделения синтетических полимеров, имеющих широкое ММР. Обычно для этой цели применяли наборы из трех - пяти колонок, содержащих сорбенты с последовательно возрастающим размером пор

(например, µ-стирогель 102+103+104+105?)*, области разделения которых перекрываются. При этом, как правило, получали калибровочную зависимость с линейным диапазоном около трех порядков и с достаточно большими криволинейными участками, а продолжительность анализа (при наиболее типичной скорости потока 1 мл/мин) составляла 40-45 мин. Главным недостатком данной калибровки является существенное ухудшение селективности разделения на криволинейных участках, что заметно снижает точность результатов. Кроме того, резко усложняется обработка экспериментальных дан-ных. Поэтому особое значение имеет выбор такой разделительной системы, которая характеризуется линейной зависимостью логарифма молекулярной массы полимера от удерживаемого объема. В этом случае можно рассматривать хроматограмму как зеркальное отображение дифференциальной кривой ММР в логарифмическом масштабе.

Предложен принцип бимодального распределения размеров пор, который позволяет составлять наборы колонок с значительно лучшими рабочими характеристиками. В соответствии с этим принципом, для составления набора колонок с линейной калибровочной зависимостью в широком интервале молекулярных масс нужно использовать только два сорбента с размерами пор, отличающихся на один-полтора порядка и имеющих умеренно узкое распределение пор по размеру. Разделительная емкость С2 колонок с этими сорбентами должна быть примерно одинаковой. Полученные бимодальные наборы колонок, как правило, имеют линейный участок калибровочной кривой, перекрывающий около четырех порядков изменения молекулярной массы, и умеренную разрешающую способность. За счет сокращения числа колонок соответственно уменьшается продолжительность разделения. Так, бимодальные наборы, выпускаемые фирмой «Дюпон» и состоящие из колонок с зорбаксами PSM-60 и PSM-1000 длиной по 25 см, имеют линейную калибровку в диапазоне молекулярных масс от 2-102 до 106 и гарантированную эффективность не менее 20 000 т. т.

Дальнейшие исследования показали, что необходимое распределение пор сорбента по размерам, обеспечивающее линейную калибровку в любом заданном диапазоне молекулярных масс, в общем случае является мультимодальным и может быть рассчитано на ЭВМ.

Таким образом, имея несколько сорбентов разной пористости с известным распределением пор по размеру, можно рассчитать состав смешанного «линейного» сорбента.

Так, калибровочная зависимость тримодального сорбента на основе макропористых стекол в диапазоне молекулярных масс от 2-103 до 4-105 имела значительно более высокую степень линейности, чем у бимодальных наборов, описанных в работе.

Линейные наборы можно составлять и из колонок с полужесткими гелями. Приведем пример составления линейного набора из колонок с стирогелями в том случае, когда разделительная емкость первой колонки заметно меньше, чем второй. Полученная калибровочная зависимость представляет собой ломаную линию с точкой излома, соответствующей молекулярной массе около 20 000 (верхний предел селективного диапазона первой колонки). При подключении еще одной колонки с размером пор 500 Д разделительная емкость в диапазоне масс до 20 000 увеличилась примерно вдвое, а калибровочная зависимость набора стала практически линейной в диапазоне молекулярных масс от 5-102 до 2-106.

По мнению Йоу с сотр., колонки с жесткими гелями лучше подходят для сочетания в бимодальные наборы, так как свойства этих сорбентов более стабильны от партии к партии. Однако следует отметить, что в последние годы качество колонок с полужесткими гелями и воспроизводимость их характеристик значительно улучшились. Отмечено, что современные полимерные сорбенты более однородны по размерам пор, чем сорбенты на основе силикагелей [28]. Опыт работы одного из авторов с колонками типа ц-сферогель показал, что соединение различных колонок требуемой пористости, взятых «через одну» (например, 5-102+1040 или 103+1050), в большинстве случаев позволяет получить линейную калибровочную зависимость в диапазоне около 4 порядков.

Оптимизацию разделительной системы целесообразно рассмотреть на примере исследования образца, о котором не известно ничего, кроме растворимости (в воде или в органическом растворителе). Предварительное разделение образца проводят на бимодальном наборе колонок с широким диапазоном разделения. В зависимости от вида получаемой хроматограммы (рис. 3) изменяют разделительную систему в соответствии с рекомендациями, приведенными ниже.

Набор оптимален.

Недостаточный диапазон разделения: имеются высокомолекулярные фракции, попадающие в область эксклюзии. Необходимо добавить колонку с более крупными порами.

Имеются фракции, попадающие в область эксклюзии; колонка II не участвует в разделении. Необходимо заменить ее на колонку с более крупными порами, чем у колонки I.

Рис. 3. Различные виды хроматограмм неизвестного образца: 1 - область разделения крупнопористой колонки; 2 - область разделения мелкопористой колонки

Колонка II не участвует в разделении. Следует использовать две колонки типа I.

Улучшение разделения можно получить на двух колонках со средним размером пор.

6. Недостаточная селективность разделения; колонка I не участвует в разделении.

Следует использовать две колонки типа II.

Если в любом из рассмотренных вариантов необходимо повысить эффективность разделения, то следует удвоить число колонок, входящих в выбранный набор.

Описанный процесс оптимизации не учитывает особенностей, связанных с адсорбцией анализируемых веществ и другими побочными явлениями. Устранение адсорбции за счет модификации подвижной фазы рассмотрено ниже.

Для предотвращения специфических затруднений, возникающих при эксклюзионной хроматографии биололимеров, витаминов и различных лабильных соединений, в последнее время чаще всего используют сорбенты с привитой карбогидратной (типа диол) или эфирной фазой (µ-бондагель Е) и полимерные сорбенты, предназначенные для работы в водных средах.

Выбор растворителя

Растворители, применяемые в эксклюзионной хроматографии, должны удовлетворять следующим основным требованиям:

полностью растворять образец при температуре разделения;

смачивать поверхность сорбента и не ухудшать эффективность колонки;

предотвращать адсорбцию (и другие взаимодействия) разделяемых веществ с поверхностью сорбента;

обеспечивать максимально высокую чувствительность детектирования;

иметь низкую вязкость и токсичность.

Кроме того, при анализе полимеров имеет существенное значение термодинамическое качество растворителя: весьма желательно, чтобы он был «хорошим» по отношению к разделяемому полимеру и матрице геля. Свойства, наиболее распространенных растворителей для эксклюзионной хроматографии приведены в приложении 2.

Растворимость образца обычно является главным лимитирующим фактором, ограничивающим ассортимент пригодных подвижных фаз. В приложении 3 указаны основные типы полимеров, которые целесообразно анализировать в тех или иных растворителях.

Наилучшим органическим растворителем для эксклюзионной хроматографии синтетических полимеров по комплексу свойств является тетрагидрофуран. Он обладает уникальной растворяющей способностью, низкой вязкостью и токсичностью, лучше многих других растворителей совместим со стирол-дивинил-бензольными гелями и, как правило, обеспечивает высокую чувствительность детектирования при использовании рефрактометра или УФ-детектора в области до 220 нм. Для анализа высокополярных и нерастворимых в тетрагидрофуране полимеров (полиамиды, полиакрилонитрил, полиэтилен-терефталат, полиуретаны и др.) обычно используют диметилформамид или м-крезол, а разделение полимеров низкой полярности, например различных каучуков и полисилоксанов, часто проводят в толуоле или хлороформе. Последний является также одним из лучших растворителей при работе с ИК-детектором. о-Дихлорбензол и 1,2,4 - трихлор-бензол применяют для высокотемпературной хроматографии полиолефинов (обычно при 135 °С), которые в других условиях не растворяются. Эти растворители имеют очень высокий показатель преломления, поэтому иногда их целесообразно использовать вместо тетрагидрофурана для анализа полимеров с низким коэффициентом преломления, что позволяет повысить чувствительность при детектировании рефрактометром.

Для предотвращения окисления растворителей и полужестких гелей в условиях высокотемпературной эксклюзионной хроматографии к о-дихлорбензолу и 1,2,4 - трихлор-бензолу добавляют антиокислители - 1,3 г/л 2,6 - ди-mреm-бутил-4-метилфенола (алко-фен БП, ионол) или 0,4 г/л 4,4/-тиo-биc (6-трет-бyтил-3-метилфенол) а (тиоалкофен БМ, сантонокс R).

Жесткие сорбенты совместимы с любыми подвижными фазами, имеющими рН<8-8,5; при более высоких значениях рН силикагель начинает растворяться и колонка необратимо теряет эффективность. Стирол-дивинилбензольные гели совместимы в основном с

элюентами умеренной полярности. Для работы на колонках с µ-стирогелем (от 103? и выше), по данным фирмы «Уотерс», пригодны тетрагидрофуран, ароматические и хлорированные углеводороды, гексан, циклогексан, диоксан, трифторэтанол, гексафтор-пропанол и диметилформамид.

Степень набухания частиц геля в различных растворителях неодинакова, поэтому замена элюента в колонках с данными сорбентами может привести к снижению эффективности за счет изменения объема геля и образования пустот. При использовании неподходящих растворителей (ацетон, спирты) происходит столь сильная усадка геля, что колонка оказывается безнадежно испорченной. У сорбентов с малым размером пор (типа µ-стирогеля 100? и 500?) такая усадка наблюдается как в полярных, так и в неполярных растворителях, поэтому с ними, кроме того, нельзя работать в насыщенных углеводородах, фторированных спиртах и диметилформамиде. Удобным, хотя и весьма дорогим выходом из положения является использование отдельных наборов колонок для каждого применяемого растворителя. Некоторые фирмы с этой целью выпускают колонки с одним и тем же размером пор, заполненные разными растворителями - тетрагидро-фураном, толуолом, хлороформом и диметилформамидом.

Для предотвращения усадки геля рекомендуется следующий способ замены растворителя: колонку, содержащую растворитель А, присоединяют к насосу, устанавливают скорость потока растворителя А 0,3-0,5 мл/мин, проводят градиентное изменение состава элюента от 0 до 100% растворителя В со скоростью 1%/мин и промывают с той же скоростью растворителем В в течение 1,5-2 ч. Резкое изменение полярности растворителя почти всегда приводит к ухудшению характеристик колонки, и его лучше вообще избегать. Если такая замена все же необходима, то следует использовать промежуточный растворитель. Так, толуол сначала заменяют на тетрагидрофуран и через 1-2 дня - на диметилформамид. Падение эффективности при этом будет меньше, чем при одностадийной замене растворителя. В любом случае замена подвижной фазы в высоко-

эффективных колонках с полужесткими гелями остается весьма деликатной операцией, требующей особой осторожности. В принципе возможно приготовление таких колонок и для работы с полярными растворителями. Нужный растворитель при этом используют при набивке колонки. Однако вследствие малой набухаемости гелей в этих растворителях получаемые колонки обычно имеют более низкую эффективность.

При разделении макромолекул основной вклад в размывание полосы определяется затрудненной массопередачей. К сожалению, многие из применяемых элюентов имеют высокую вязкость. Для снижения вязкости (а также для улучшения растворимости) экс-клюзионную хроматографию часто проводят при повышенных температурах, что существенно улучшает эффективность хроматографической системы.

Анализ большинства полимеров на жестких гелях часто осложняется их адсорбцией. Для подавления адсорбции обычно используют растворители, которые адсорбируются на насадке колонки сильнее, чем анализируемые вещества. Если по каким-либо причинам это невозможно, то подвижную фазу модифицируют добавкой 0,1-2% полярного модификатора, например тетрагидрофурана. Значительно более сильными модификаторами являются этиленгликоль и полигликоли с различной молекулярной массой (ПЭГ-200, ПЭГ-400, карбовакс 20 М). Иногда, например при анализе поликислот в диметилформамиде, требуется добавка достаточно сильных кислот. Следует отметить, что полностью устранить адсорбцию добавкой модификаторов удается не всегда. В таких случаях нужно использовать полужесткие гели. Некоторые полимеры хорошо растворяются только в высоко полярных растворителях (ацетон, диметилсульфоксид и т.п.), несовместимых со стирол-дивинилбензольными гелями. При их разделении на жестких сорбентах выбор растворителя проводят в соответствии с общими принципами, изложенными выше.

Иная ситуация имеет место при проведении эксклюзионной хроматографии в водных средах. Из-за специфических особенностей многих разделяемых систем (белки, ферменты, полиэлектролиты и др.) и разнообразия применяемых сорбентов существует очень много вариаций состава подвижной фазы для подавления различных нежелательных эффектов. Общими приемами модификации является добавка различных солей и применение буферных растворов с определенным значением рН. В частности, поддержание рН=<4 дает возможность подавить слабую ионообменную активность силикагелей, обусловленную присутствием на их поверхности кислых силанольных групп. Требуемая ионная сила подвижной фазы достигается при концентрации буферного раствора 0,05-0,6 М; оптимальную концентрацию подбирают экспериментально. Для предотвращения ионообменной сорбции катионных соединений наиболее часто используют такой активный модификатор, как тетраметиламмонийфосфат при рН?3. Однако при разделении некоторых белков могут проявляться гидрофобные взаимодействия, в свою очередь осложняющие эксклюзионный механизм разделения. Те же эффекты иногда проявляются и при работе с дезактивированными гидрофильными сорбентами. Для их устранения к растворителю добавляют метанол. Иногда в водную подвижную фазу вводят полярные органические растворители, полигликоли, кислоты, основания и поверхностно-активные вещества.

Литература

Aleksandrov M.L. e. a./J. High Resol. Chromatogr. Commun, 1983, v. 6, No. 11, p. 629-631.

Yau W., Grinnard G., Kirkland /./J. Chromatogr., 1978, v. 149, p. 465.

Виленчик Л. 3. и dp. / Высокомол. соед., 1980, т. А22, №11, с. 2801-2804.

Нестеров В.В. и dp. / Высокомол. соед., 1984, т. Б26, №3, с. 163-167.

Benson J.R., Woo D. /./J. Chromatogr. Sci, 1984, v. 22, No. 9, p. 386 - 399.

Zdanov S.P. e. a./J. Chromatogr, 1973, v. 77, No. 2, p. 149-159.

Schlechter /./Anal. Biochem, 1974, v. 58, No. 1, p. 30.

Нефедов П.П. и dp. / Высокомол. соед, 1981, т. А23, №5, с. 943-950.

Nakamura К., Endo R./J. Appl. Polym. Sci, 1981, v. 26, p. 2657-2664.

Ициксон Л.Б., Филиппов А.А. // В кн.: Ill Всесоюзный симпозиум по молекулярной жидкостной хроматографии, тезисы докладов. Рига, изд. Института органич. синтеза АН Латв. ССР, 1984, с. 126-127.

Страницы: 1, 2