5.1 Титриметрический метод количественного определения производных кумарина основан на способности а-пиронового кольца раскрываться под действием щелочи, но в настоящее время он практически не используется. Избыток щелочи затем оттитровывают хлороводородной или серной кислотой. В связи с получением заниженных результатов была разработана модифицированная методика с использованием оксида ртути, которая исключает преждевременное замыкание лактонного кольца. Существенным достоинством титриметрического метода является отсутствие потребности в стандартных образцах кумаринов, недостатком -- низкая специфичность и токсичность соединений ртути. Тем не менее, эта методика использовалась в нормативной документации на псорален и его лекарственные формы.

5.2. Одним из вариантов применения лактонной пробы является гравиметрический метод. Несмотря на несомненное достоинство -- высокую точность, сравнимую со спектрофотометрическим определением, -- он не получил широкого применения из-за трудоемкости и длительности.

5.3. Имеются литературные данные о применении перманганатометрии при количественном определении кумарина, однако этот метод дает недостаточно точные результаты.

5.4. Кислотные свойства природных гидроксикумаринов были изучены при помощи метода потенциометрического титрования в воде и некоторых неводных растворителях. Влияние строения кумаринов на характер кривых потенциометрического титрования позволяет использовать последние для установления структуры соединений наряду со спектрами их поглощения.

5.5. Колориметрические методы количественного определения кумаринов.

К спиртовому извлечению прибавляют 10% спиртовой раствор КОН, нагревают - раствор желтеет, прибавляют свежеприготовленный диазореактив (смесь равных объёмов пара-нитроанилина и раствора нитрита натрияв концентрированной НСl) при наличии кумаринов раствор приобретает окраску от коричневой до вишнёвой. Данный метод был применен для анализа кумаринов Heracleum sp., бергаптена в плодах Pastinaca sativa L., псоралена в субстанции и лекарственных препаратах, атамантина в корнях Peucedanum oreoselinum L. (Moench.), ксантотоксина и бергаптена в плодах Ammi majus L. и в препарате "Аммифурин".(11) (2):

5.6 Имеются данные о применении фотоколориметрического метода для количественного определения синтетического антикоагулянта синкумара. Однако необходимо отметить, что реакция азосочетания не является специфичной для кумаринов и их производных (сходные эффекты способны давать фенолы, ароматические амины и флавоноиды). Перед проведением фотоколориметрии необходима тщательная очистка от сопутствующих веществ. Кроме того, диазопроизводные кумаринов имеют различия в спектрах поглощения, обусловленные спецификой строения исходного вещества.

5.7 Спектрофотометрический метод основан на способности кумаринов к поглощению в УФ-области спектра. Показано, что основные полосы поглощения в спектрах кумаринов и фурокумаринов обусловлены переходами 7г-электронов со связанных молекулярных орбиталей на разрыхляющие. Наличие нескольких характерных полос высокой интенсивности в диапазоне 220 - 350 нм позволяет использовать УФ-спектрофотометрию для количественного определения содержания кумаринов. Характерные максимумы поглощения приведены, в частности, в работах отечественных исследователей.

Из групповых методов анализа кумаринов УФ-спектрофотометрический метод является наиболее перспективным, т.к. позволяет проводить компонентный анализ на основе различий спектров поглощения, не требует предварительного разделения и относительно прост в аппаратурном оформлении. Однако при его применении желательно наличие стандартных образцов, позволяющих более точно, чем в случае использования калибровочных графиков и удельных показателей поглощения, устанавливать содержание целевых компонентов.

Методом УФ-спектрофотометрии установлено, что в спектрах поглощения синтетических антикоагулянтов -- дикумарина, фепромарона и синкумара -- наблюдаются две характерные полосы в области 280 и 306 нм, первая из которых имеет колебательную природу, а вторая соответствует р-п-сопряжению бензольного и пиронового циклов.

5.8 Прямая спектрофотометрия при длине волны 352 нм с использованием рабочего стандартного образца ксантотоксина была предложена для оценки качества препарата "Аммифурин". Совместное применение ТСХ и спектрофотометрии делает методику более точной. Возможно использование ТСХ на силикагеле КСК254 5/40 в системе петролейный эфир -- этилацетат (1:1), после элюирования пятен этиловым спиртом определяется оптическая плотность. Применим аналогичный метод с использованием бумажной хроматографии на бумаге, импрегнированной метанольным раствором формамида в системе растворителей гептан - бензол (4:1). В работе рассмотрена возможность проведения количественного определения пеуцеданина в растительном сырье и препарате с использованием ТСХ на пластинке с незакрепленным силикагелем в системе петролейный эфир -- диэтиловый эфир (1:2). Элюирование пятен осуществляют этанолом. При длине волны 298 нм проводят определение удельного показателя поглощения вещества, который используют для расчета его содержания. Существенным преимуществом применения спектрофотометрии в данном случае стала возможность определения примеси ореозелона, поглощающего при 345 нм. Количественное содержание птериксина в корнях Libanotis densiflora и в препарате "Либоверин" предложено определять по следующей методике: ТСХ на силикагеле КСК в системе н-гексан -- бензол -- метанол (5:4:1), элюирование пятен этиловым спиртом и измерение оптической плотности элюата при длине волны 322 нм. Расчет проводят по удельному показателю поглощения птериксина.

5.9 Хроматоспектрофотометрические методики разработаны также для определения количественного содержания псоралена и суммы фурокумаринов в плодах Psoralea drupacea Bge. с использованием стандартных образцов псоралена и ангелицина. С использованием удельного показателя поглощения ксантотоксина возможен и спектрофотометрический метод оценки качества плодов Pastinaca sativa L..

Псорален и бергаптен в препарате "Фурален" можно определить количественно, без разделения суммы кумаринов, при длине волны 297,5 нм, либо при двух длинах волн. Последний принцип положен в основу анализа листьев Ficus carica L., субстанции псоберана и его препаратов. Предложенный метод основан на модификации хроматоспектрофотометрического метода: при 298 нм определяется сумма фурокумаринов, а при 246 и 268 нм, где наблюдается наибольшая разность в интенсивности поглощения -- содержание псоралена. Количество бергаптена определяется по разности. В качестве стандартного образца используется псорален.

При помощи УФ-спектрофотометрии возможно также определение молекулярной массы кумаринов и фурокумаринов. УФ-спектры могут быть использованы как один из методов идентификации выделенных из растения кумаринов, а также при исследовании их физиологической роли. Описано использование данного метода для оценки биодоступности дикумарола.

5.10 Полярографический метод применяется для анализа готовых лекарственных форм фурокумаринов и обусловлен их восстановлением на ртутно-капельном электроде в а-пироновом кольце по двойной связи в положении 3,4. На основании изучения физико-химических свойств природных кумаринов предложены методики качественного, количественного и функционального анализа, которые вошли в фармакопейные статьи на келлин, псорален, виснадин, пастинацин, некоторые виды лекарственного растительного сырья и лекарственные формы. В частности, для контроля качества плодов Pastinaca sativa L. были использованы полярографический и хроматополярографический методы с использованием стандартного образца ксантотоксина. При сочетании полярографии и хроматографии изучался химический состав кумаринов ряда растений и природных продуктов. Имеются литературные данные о методике количественного определения кумарина и коричной кислоты, применяемых в качестве стабилизаторов в инъекционном растворе ФиБС. Несомненным достоинством метода является возможность быстро и точно анализировать сумму кумаринов без предварительного выделения отдельных компонентов, однако следует учитывать, что из-за высокой чувствительности к электрохимически активным примесям требуется тщательная предварительная подготовка.

В настоящее время для анализа кумаринов метод полярографии практически не используется.

5.11 Флуоресцентный анализ

Многие кумарины и фурокумарины проявляют характерную (желтую, зеленую, голубую или фиолетовую) флуоресценцию при УФ-возбуждении в нейтральных спиртовых растворах, в растворах щелочей и концентрированной серной кислоте в видимой и ультрафиолетовой областях спектра. Флуоресценция усиливается в щелочной среде за счет образования хиноидной структуры, в кислой среде флуоресценция менее выражена. По величине стоксового сдвига и максимуму флуоресценции предлагается проводить идентификацию фитохимических препаратов. Для кумаринов и фурокумаринов получены спектры флуоресценции и установлена линейная зависимость ее интенсивности от концентрации, что позволило применить метод флуороденситометрии для количественного определения фурокумаринов псоралена и ангелицина в препарате псорален. Образование флуоресцирующих соединений компонентов препаратов "Аммифурин", "Бероксан" и "Пастинацин" с насыщенным раствором брома в щелочной среде позволило идентифицировать их на основании одинаковых максимумов возбуждения (380 нм) и флуоресценции (480 нм).

Предложен флуориметрический метод определения количественного содержания фурокумаринов в плодах Pastinaca sativa L. при длине волны возбуждения 350 нм и флуоресценции 470 нм. Аналогичная методика приведена и для близкого структурного аналога кумаринов, келлина, в плодах Ammi visnaga L. (Lam.).

Также предложен селективный способ количественного определения неодикумарина путем последовательной обработки анализируемой пробы в диметилформамиде раствором аммиака и насыщенным раствором магния хлорида в этом же растворителе.

Флуоресценция производных кумарина зависит от концентрации водородных ионов, поэтому данные об изменении окраски и интенсивности флуоресценции в различных пределах рН, а также в зависимости от строения кумаринов могут оказаться необходимыми при использовании флуориметрических методов. Количественный анализ с использованием данного метода не получил широкого распространения из-за не всегда проявляющейся линейной зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации.

В литературе имеются данные об использовании 7-(2-бромэтокси) кумарина в качестве флуоресцентной метки для количественного флуориметрического анализа лекарственных препаратов, содержащих третичный атом азота.

Возможно применение флуоресцентной микроскопии для локализации и определения количества гидроксилированных производных кумарина, выполняющих роль фотопротекторов, в зеленых водорослях Da-sycladis vermicularis (Scopoli) Krasser.

Интерес представляет флуоресцентный экспресс-метод обнаружения кумарина в топливе, основанный на реакции его щелочного гидролиза с образованием о-кумаринат-ионов и последующим их превращением в о-кумарат-ионы, обладающие интенсивной флуоресценцией.

5.12 Бумажная хроматография чаще всего сочетается с другими физико-химическими методами. Например, после разделения суммы кумаринов на бумаге (петролейный эфир; ДМФА в ацетоне) возможно полярографическое определение суммы фурокумаринов в плодах Pastinaca sativa L. и в препарате "Бероксан". Сочетание бумажной хроматографии с фотоколориметрическим определением на основе реакции с диазотированной сульфаниловой кислотой используют для анализа фурокумаринов Psoralea drupacea Bge., псоралена и бергаптена в листьях Ficus carica L.. Этот же метод использован для определения фурокумаринов в некоторых видах зонтичных. К существенным недостаткам БХ относятся длительность проведения анализа и необходимость концентрирования вытяжки из-за малой сорбционной емкости бумаги.

5.13 Метод тонкослойной хроматографии в значительной степени лишен указанных недостатков, т.к. позволяет относительно быстро производить разделение компонентов смеси. Как и БХ, его можно использовать для идентификации кумаринов в исследуемых препаратах.

Имеются данные о колориметрических методах количественного определения пеуцеданина в корнях Ре-ucedanum morrissonii Bess., основанных на реакции азосочетания, с разделением на тонком слое оксида алюминия в системе гексан -- бензол -- метанол (5:4:1), и для анализа бероксана, пастинацина и псоралена. Также описано колориметрическое определение ксантотоксина, императорина и бергаптена в Ammi majus L. после хроматографирования на си-ликагеле, импрегнированном формамидом, в системе дибутилового эфира. Предложена методика определения псоралена и суммы псоралена и бергаптена, по отдельности, в листьях Ficus carica L.. При этом очищенный от балластных веществ экстракт хроматографируют в тонком слое оксида алюминия в диэти-ловом эфире, а затем при помощи УФ-спектрофотометрии устанавливают содержание кумаринов. Имеются литературные данные о возможности использования двумерной хроматографии в слое силикагеля для определения бергаптена в системах гексан -- четыреххлористый углерод -- трет-бутиламин (180:12:9) и гексан -- толуол -- этилацетат - уксусная кислота (100:10:10:0,5) в сочетании со спектрофлуориметрией.

Последнее десятилетие характеризуется широким использованием ГЖХ и ВЭЖХ для решения задач, связанных с разделением и оценкой качества различных соединений класса кумаринов.

5.14 Газожидкостная хроматография (ГЖХ) применяется в основном для идентификации и количественного анализа фурокумаринов в препаратах и растительном сырье. Установлено различие во временах удерживания для замещенных фурокумаринов. Из общих закономерностей следует упомянуть следующие: при переходе от гидрокси- к метоксикумаринам время удерживания уменьшается (снижается возможность сорбции за счет водородных связей), а фурокумарины с О-алкильным заместителем при С5 регистрируются позже, чем 8-гидроксиизомеры. Кроме того, отмечено, что величина десятичного логарифма относительного времени удерживания линейно зависит от молекулярной массы вещества. Полученные данные могут быть использованы при определении структуры или времени удерживания сходных кумаринов.

Описано также определение псоберана в субстанции методом ГЖХ.

Для анализа корней Phlojodicarpus sibiricus и фловерина предлагается ГЖХ методом абсолютной калибровки после экстракции кумаринов хлороформом в сравнении со стандартным образцом фловерина. При этом дигидросамидин и виснадин выходят одним симметричным пиком. Сравнение проводят со стандартным образцом фловерина. Раздельное определение виснадина и дигидросамидина возможно после предварительного переведения солей, образовавшихся при щелочном гидролизе, в свободные кислоты. Кислоты экстрагируют эфиром и хроматографируют. Аналогичный метод применяют для анализа аммифурина и плодов Ammi majus L. после экстракции их этиловым спиртом. В качестве внутреннего стандарта используют стандартный образец ксантотоксина.

Метод газовой хроматографии также применяется для обнаружения кумарина и его метаболитов в печени животных и человека.

5.15 Широкое распространение в анализе производных кумарина и фурокумарина в настоящее время получила высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Описано одновременное количественное определение методом ВЭЖХ действующих веществ семян Coronilla varia L. (кумаринов -- скополетина, дафноретина и умбеллиферона и кардио-тонических гликозидов). Влияние метоксалена (ксантотоксина) на метаболизм никотина также проводилось при помощи этого метода.

Имеются данные об исследовании содержания кумарина в зависимости от времени заготовки южноамериканского растения Mikania laevigata, применяемого метода экстракции и экстрагента. Предложено использовать ВЭЖХ в изократическом режиме для разделения, одновременного качественного и количественного анализа кумаринов коры Aesculus hyppocasta-пит L. без предварительной очистки, для количественной оценки кумарина в листьях Mikania glomera-ta Spreng . Известна методика определения кумаринов с помощью ВЭЖХ в градиентном режиме (флуоресцентный детектор) при изучении биохимических функций кумаринов в корнях подсолнечника (Heliant-hus annum L.).

Весьма перспективным методом является сочетание ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Предложены соответствующие методики определения антикоагулянтов непрямого действия и родентицидов кумаринового ряда (производные 4-гидроксикумарина) в плазме крови в практике токсикологического анализа. Определенный интерес представляет использование хроматомасс-спетрометрии для определения наличия кумарина в табачной продукции.(7)

Заключение

Для выделения суммы кумаринов из ЛРС было предложено использовать экстракцию этиловым спиртом различных концентраций с последующей очисткой хлороформом. Изучение качественного состава кумаринов проводили с использованием различных методов хроматографии -- бумажной, тонкослойной и ВЭЖХ.

Качественный анализ производных кумарина, содержащихся как в экстракте, так и в лекарственных формах можно проводить, используя для этих целей как химические, так и физико-химические методы.

В качестве химических методов идентификации кумаринов используется общепринятая реакция азосочетания, лактонная проба, а также другие цветные реакции. Эти способы могут быть использованы в методах ТСХ и БХ, а также непосредственно путем проведения химических реакций с извлечением.

Качественное определение суммы кумаринов предложено проводить методом ТСХ на пластинках Сорбфил в системе бензол - этилацетат (1:2) с последующей обработкой раствора спиртовым раствором щелочи. Пятна идентифицируют по величине Rf и желтой окраске. Однако как уже было отмечено, реакция с диазореактивами неспецифична для кумаринов, к тому же значения Rf не всегда воспроизводимы, поэтому целесообразно применение ТСХ со стандартным образцом преобладающих соединений данного класса.

При использовании УФ-спектрофотометрии идентификацию кумаринов проводят по наличию полос поглощения при определенных длинах волн. ВЭЖХ предполагает нахождение параметров удерживания.

Для количественного определения суммы кумаринов в ЛРС были предложены такие методы, как титриметрия, гравиметрия, фотоколориметрия, УФ-спектрофотометрия и ВЭЖХ.(5,7)

Литература

1. Арзамасцев, А.П. Фармацевтическая химия - М.:Гэотар-мед,2004.-635 с.

2. Беликов, В.Г. Фармацевтическая химия - Пятигорск, 2003. - 715 с.

3. Государственная фармакопея СССР XI издание / 1 и 2 т. - М.: Медицина,1987. - 334 с., 1990. - 398 с.

4.Кемертелидзе, Э.П. Физико - химические методы анализа некоторых биологически активных веществ растительного происхождения - Тбилиси, 1976. - 198 с.

5. Коноплёва, М.М. Фармакогнозия: Природные биологически активные вещества - Витебск 2007. - 272 с.

6. Кузнецова, Г.А. Природные кумарины и фурокумарины - Л., 1967, 28 с.

7. Ложкин, А.В. Природные кумарины: методы выделения и анализа /А.В. Ложкин, Е.И. Сакалян // Хим. - фарм. журн. - т.40, №6 - 2006 - с 47 - 57

8. Машковский, М.Д. Лекарственные средства - Москва 2005

9. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. - М.: АстраФармСервис, 1995 - 2007

10. Фармакопея РБ, 1т.

11. Шелюто, В.Л. Фармакогнозия - Витебск,2003 - 490 с.

Страницы: 1, 2, 3