В молекулі PhOH вразливий О-Н зв'язок, що легко атакується пероксидним радикалом. Висока реакційна здатність фенолів пояснюється в основному невисокими значеннями міцності О-Н зв'язків.

Феноли інтенсивно обривають ланцюг за реакцією з у концентраціях, що на 4-5 порядків менше, ніж концентрація вуглеводню, що окисляється. Цьому відповідає різниця в k2 і k7 на кілька порядків. Таке велике розходження не зв'язане лише з міцністю зв'язків С-Н у вуглеводнях і О-Н у фенолах, а викликано різними активаційними бар'єрами цих реакцій. Як показано в роботі [28], велике розходження в енергіях активацій реакцій 2 і 7 викликано триплетним відштовхуванням і внеском незв'язуючої орбіталі Y…...OOR у створенні активаційного бар'єра в реакції типу Чим міцніше зв'язок Y-OOR, тим більше енергія незв'язуючої орбіталі і вище її внесок триплетного відштовхування, що складає 27,6 кдж/моль, а у випадку фенолів він близький до нуля, тому що зв'язок RO-OAr дуже слабкий. Саме тому феноли володіють високою реакційною здатністю стосовно пероксидних і алкоксильних радикалів.

Крім того, реакції з фенолом, мабуть, передує утворення водневого зв'язку:

Вимірювана на досвіді константа швидкості цієї реакції k7 дорівнює добуткові К·k.

Час життя комплексу трохи більший, ніж час існування клітинної пари , що, видимо, позначається на константі швидкості реакції 2. Коли в розчині присутні полярні молекули, що утворюють водневий зв'язок з фенолом, це, природно, сповільнює реакцію і знижує ефективну константу швидкості реакції k7.

Аналіз значень k7 показує, що величина цієї константи слабко залежить від природи пероксирадикалів і визначається, в основному, структурою інгібітору [13,15,30]. Характер замісників, їхнє положення в ароматичному кільці інгібітору з однієї сторони впливають на міцність О-Н зв'язку в молекулах інгібітору, а з іншої на активність радикалів, що утворюються з нього .

Феноксильні радикали багатьох фенолів порівняно стійкі через делокалізацію вільного гетероатома з р-електронами ароматичного кільця, що дає можливість вивчати їхні властивості і визначати будову продуктів. При великих концентраціях радикалів в системі з продуктами перетворення є, головним чином, сполука ROOIn (реакція 8).

В умовах інгібованого окиснення з реакцією 8 конкурує реакція бімолекулярної загибелі (реакція 9). В залежності від співвідношення []/[] і структури феноксила може переважати той або інший шлях. Можлива димеризація феноксильних радикалів за положеннями 2, 4, 6 ароматичного кільця, яка є зворотньою і не призводить до утворення стабільних продуктів. Основний шлях їх зворотньої бімолекулярної загибелі при наявності в феноксилі слабко зв'язаних атомів водню - диспропорціонування з утворенням метиленхінона і регенерацією вихідного фенолу [30].

Механізм дії інгібіторів досить складний і включає крім реакції обриву ланцюга ряд інших елементарних реакцій за участю молекул і радикалів інгібітору.

Оскільки феноли - відновники, а обрив ланцюга на інгібіторі - реакція окиснення, той будь-який інший окисник, що знаходиться в системі, буде реагувати з молекулою інгібітору. Такими окисниками в системі завжди є гідропероксид і молекулярний кисень. Якщо в результаті реакції інгібітору з цими речовинами утворюються тільки молекулярні продукти, то відбувається додаткова витрата інгібітору, що знижує його активність. Якщо ж у результаті реакції утворюються вільні радикали, то реакція служить додатковим джерелом ініціювання.

Активність різних фенольних сполук як вільнорадикальних АО досліджувалася на великій кількості систем, включаючи ліпіди в білку, емульговані ліпіди й інші складні харчові матеріали. В жировмісних системах, таких як емульсії, АО можуть розподілятися між гідрофобною ліпідною фазою, гідрофільною водною фазою і міжфазним середовищем. Ці системи відносять до гетерофазних, тому що ліпіди утворюють різні дискретні середовища, в залежності від їхніх фізичних властивостей, через несумісність з водними системами.

Ліпофільний характер АО, обумовлений його розподілом між фазами, розрізняється в полярності. Одною важливою рушійною силою для розподілу є енергія віддалення утримуваної водної оболонки, що утворюється навколо АО у водній фазі.

Сили взаємодії між молекулами, що є результатом притягання між різними функціональними групами, можуть призвести до різного характеру розподілу. З одного боку, загальний склад дискретних фаз може викликати розходження в полярностях, що так само впливає на характер розподілу АО [31].

Розходження в ефективності антиоксидантів у дискретних ліпідних системах можна віднести до різної розчинності АО в різних фазах колоїдних харчових систем [32,33].

Активність зростає при наявності притягання заряджених частинок і знижується при відштовхуванні ліпідної поверхні і гідрофільних АО [7,34].

На підставі розходжень антиоксидантної активності було припущено, що міжфазний розподіл антиоксидантів - важлива фізико-хімічна властивість, що може значно впливати на їхню активність, і значний вплив робить константа розподілу сполук на доступ до радикалів у ліпофільній фазі, а не прямий розгляд швидкостей захвату радикалів [34].

В деяких дослідженнях показано [32], що відносна активність АО може змінюватися, якщо порівнювати системи з розходженнями в розподілі ліпідної фази. Повідомили, що гідрофільні антиоксиданти менш ефективні в м/в (полярних) емульсіях і мембранних системах, чим гідрофобні. Антиоксидантний потенціал сполук різний при різних способах окиснення або, для того самого досліду, при різній полярності середовища, оскільки взаємодія АО з іншими сполуками відіграє важливу роль в активності. Спостерігали протилежні результати, коли та сама модельна сполука є сильним АО в одному методі і прооксидантом в іншому. Це явище, назване “полярним парадоксом”, описано в роботі [32], гідрофільні АО більш ефективні в масі олії, тоді як ліпофільні мають велику активність в емульсіях.

Загальна тенденція така, що поліпшена стабілізація феноксильного радикала - бажана, але ліпофільна природа молекул і спорідненість АО до ліпідів може бути визначальним [35].

Оскільки вважається, що окиснення ліпідів відбувається в середовищі міцели або на поверхні ліпіду, необхідні систематичні дослідження розподілу АО в ліпідвмісних гетерофазних системах.

1.4. Методи дослідження біологічного окиснення

Для дослідження процесів пероксидного окиснення ліпідів в біологічних системах використовують вільнорадикальні інтермедіати ПОЛ (головним чином алкильні та алкилперекисні вільні радикали), продукти першого єтапу ланцюга окиснення ліпідів - їх гідропероксиди; проміжні, чи вторинні сполуки, які утворюються в результаті розпаду гідропероксидів, та кінцеві продукти ПОЛ [27]:

Труднощі аналізу продуктів ПОЛ визначаються наступними причинами:

1 - в кожний момент часу вміст дієнових коньюгатів та ліпідних пероксидів є стаціонарна концентрація сполук, результат двох одночасно протікаючих процесів: утворення та розпаду, тобто підвищення вмісту ліпідних пероксидів може бути як результат збільшення швидкості їх утворення, так і навпаки - зменьшення швидкості розпаду;

2 - в добуванні біологічного матеріалу та готуванні його для аналізу стаціонарна концентрація пероксидів повинна залишатися постійною. Для запобігання накопичення пероксидів використовують антиоксиданти: токоферол, ЕДТА, а також проводять усі процедури виділення в безкисневих умовах.

Оскільки первинними молекулярними продуктами ПОЛ є гідропероксиди та діалкилпероксиди, то в основі більшості існуючих методів дослідження процесів окиснення полягає визначення вмісту гідропероксидів ліпідів реакцією відновлення їми різних барвників або іонів І- (йодометрія) [2]. В основі різноманітних модифікацій іодометричного метода лежить визначення вільного іоду, який утворюється в результаті стехіометричного відновлення пероксидних груп йодид-іоном. Недоліком цього методу є те, що крім ліпідних пероксидів в окиснювальній системі можуть утворюватись пероксиди інших класів.

Пероксиди ліпідів є достатньо нестійкими речовинами, які легко підлягають гомолітичному розпаду. Тому результати кількісного аналізу гідропероксидів відображають лише стаціонарні концентрації цих продуктів в ліпідних системах [27]. Більш стійкими є вторинні продукти ПОЛ. Особливий інтерес при цьому представляють спектральні методи (УФ-спектрофотометрія), які широко використовують при вивченні нестійких проміжних продуктів. Застосування спектрофотометричного методу обмежено тим, що в короткохвильовій області спектру суттєво поглинання ізольованих подвійних зв'язків, тобто його можна розглядати як приблизний напівкількісний.

Подальше перетворення утворених продуктів призводить до утворення малонового діальдегіду [2,27], які визначають за кольоровою реакцією з тіобарбітуровою кислотою. ТБК-тест дуже зручний для дослідженя швидкості ПОЛ в ізольованих системах. В роботі [36] проводили оцінку АОА плазми крові та фармакологічних препаратів за накопиченням ТБК-активних продуктів з використанням як модельної системи дисперсії жовточних ліпопротеїнів. В цей час найбільш чутливим методом виявлення вільнорадикальних інтермедіатів є метод, що оснований на вимірюванні інтенсивності хемілюмінесценції електронно-збуджених продуктів, які утворюються за реакцією рекомбінації ліпідних радикалів. Проте хемілюмінесцентний (ХЛ) метод дозволяє виявляти не самі радикали, а ті молекулярні продукти їх рекомбінації, що виявляються у збудженому стані, тобто ХЛ є непрямим методом регістрації ліпідних радикалів.

ХЛ свідчить про швидкість рекомбінації алкілпероксидних радикалів у зразку. Ця особливість метода може бути використана для дослідження процесів ПОЛ, які швидко розвиваються. Другою важливою перевагою цього метода є його висока чутливість (10-10М) [27].

Недолік ХЛ метода полягає у неможливості контролювати фізико-хімічні властивості ліпідів, що призводить до зниження відтворюваності результатів ХЛ досліджень.

В якості модельної системи часто використовують дисперсію жовточних ліпопротеїнів (ЖЛП). Її готують різними способами: екстракцією хлороформно-метанольною сумішшю [2]; шляхом суспензування ЯЖ в фосфатному буфері [37] або в дистильованій воді [37]. В роботах при окисненні ЖЛП використовують буфери - трис-HCl [2], фосфатний в присутності солей NaCl [38] чи KCl [39], які забеспечують фізіологічне рН = 7,4. Концентрація заліза змінюється в інтервалі 10-4 - 2*10-2 М.

Для дослідження кінетики окиснення вуглеводнів крім ХЛ широко використовують газоволюмометричний метод. Відомості про використання газометричного метода в літературі є лише для таких модельних систем як метилолеат [40], олеїнова кислота, етилбензол, але не дисперсія ЖЛП. Оскільки ліпосоми ЯЖ є найближчим аналогом біомембран, дослідження можливості їх використання в якості субстрата окиснення на газоволюмометричній установці є актуальним.

2. Експериментальна частина

2.1.1 Газоволюмометричний метод

Одним із простих і розповсюджених методів вивчення кінетики рідиннофазних реакцій окиснення органічних речовин є метод вимірювання кількості поглиненого кисню. Газоволюмометричний метод дозволяє вимірювати швидкість окиснення з великим ступенем точності при малих глибинах перетворення, коли впливом продуктів окиснення на кінетику реакції можна знехтувати.

Існують різні варіанти газоволюмометричних установок, загальний принцип їхньої дії полягає у вимірюванні швидкості поглинання кисню при постійному тиску. Визначення кінетичних параметрів процесу інгібованого окиснення: період індукції, константу швидкості реакції з пероксильними радикалами, коефіцієнт інгібування і ряд інших кінетичних характеристик проводили на установці для автоматичної реєстрації і запису поглинання кисню "Кулон-1" з фотоелектронним датчиком заводу інституту хімічної фізики РАН (рис.2.1).

Установка складається з реакційної судини (1), зануреної в термостатовану ячейку (2), термостатованої газової бюретки (3), електролітичної ячейки з платиновими електродами (електроліт - насичений розчин щавлевої кислоти) (4), регулятора тиску (5), заповненого ундеканом, і манометра (6), фотоелектроннного датчика (8), підсилювача датчика (9), стабілізатора струму (10). Перед початком досліду бюретка, регулятор тиску і реакційна судина з речовиною, що окиснюється, заповнюються до атмосферного тиску киснем. Для проведення окиснення реакційна судина нагрівається до певної температури за допомогою термостата, при безперервному перемішуванні, після двоххвилинного прогріву з'єднується з бюреткою і регулятором тиску. Фотоелектронний датчик через стабілізатор струму з'єднаний з електролітичною ячейкою. Під час реакції кисень з бюретки надходить у реакційну судину, при цьому тиск у системі падає, і в зв'язку з цим включається електролітична ячейка. Газ, що виділився з ячейки, підвищує тиск у термостатованому об'ємі і піднімає рівень ундекану в бюретці, у результаті чого тиск у системі вирівнюється. Швидкість просування меніска ундекана в бюретці пропорційна швидкості реакції.

Рисунок 2.1 -Схема газоволюмометричної установки: 1 - реакційна судина, 2- термостат, 3 - газова бюретка, 4 - електролітична ячейка, 5 - регулятор тиску, 6 - манометр, 7 - термостатований об'єм, 8 - фотоелектронний датчик, 9 - підсилювач датчика, 10 - стабілізатор струму.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5