2.2. Тонкошарова хроматографія (ТШХ)

Метод ТШХ полягає в наступному [41]: на один бік невеликої скляної пластинки наносять тонкий шар сорбента. На такий шар на стартову лінію наносять проби речовин та їх сумішей, і кінець пластинки, нище стартової лінії, занурюють в систему розчинників. За мірою просування рідини по пластинці відбувається розподіл суміші речовин. Границю підйому рідини чи лінію фронту позначають, пластинку висушують і проявляють для визначення речовин у вигляді забарвлених плям. Відмічають положення плям, які відповідають досліджуваним речовинам, що знаходяться між лінією старта і лінією фронту рідини. Для цього вимірюють відстань від центра плями до стартової лінії (АБ). Потім визначають відстань від лінії фронту рідини до стартової точки (АВ). Співвідношення відстані від стартової лінії до центра плями (АБ) та відстані від стартової лінії до лінії фронту (АВ) позначається через константу Rf, яка характеризує положення речовини на хроматограмі. Таким чином, величина Rf = АБ/АВ характерна для даної сполуки на даному сорбенті і в даній системі.

В якості носія для нерухомої фази використовують силікагель, а в якості системи розчинників - хлороформ-бензол-гексан в співвідношенні 30:6:1. По закінченню пластинку з отриманими результатами проявляють парами аміаку.

2.3. Техніка безпеки

2.3.1. Правила безпечної роботи в хімічних лабораторіях

Загальна організація роботи по техніці безпеки покладена на керівників відділів. Працювати в хімічних лабораторіях дозволяється особам віком не менше 18 років, які пройшли інструктаж з ТБ.

У всіх приміщеннях лабораторії повинна бути встановлена витяжна вентиляція. Всі роботи, пов'язані з виділенням шкідливих парів або газів, повинні проводитись у витяжних шафах. Зберігання різних хімічних речовин у лабораторіях повинно відбуватись із врахуванням їх властивостей. Залишати робоче місце і нагрівальні прибори без нагляду заборонено.

В кожній лабораторній кімнаті на певному місці повинні знаходитись вогнегасник, пісок, ковдра. Всі реактиви в лабораторіях повинні зберігатись в тарі з підписом. В лабораторії повинно знаходитись не менше двох чоловік. Всі роботи в лабораторії повинні проводитись при задовільному стані електрообладнання.

2.3.2 Основні правила безпеки при роботі з їдкими речовинами

Роботу з концентрованими кислотами та лугами без захисного обладнання заборонено. Концентрована кислота повинна зберігатись у товстостінному скляному посуді ємністю не більше 1 л у витяжній шафі. Розлиті кислоти або луги необхідно миттєво засипати піском. Після уборки піска це місце нейтралізують: кислоту - лугом або содою, луг - слабким розчином оцтової кислоти. Не можна набирати концентровані кислоти та луги в пипетки ртом. При використанні хромової суміші необхідно запобігати попаданню суміші на шкіру, одяг та взуття. Заборонено зливати концентровані кислоти та луги в каналізацію, їх слід окремо збирати в посуд і після нейтралізації зливати в зливи для неорганічних речовин.

2.3.3. Основні правила безпечної роботи з електрообладнанням та електроприладами

Заборонено переносити включені прилади та ремонтувати обладнання, що знаходиться під струмом. Заборонено працювати поруч з оголеними частинами обладнання. Заборонено загромаджувати підступи до електричних приладів. У випадку припинення подачі струму всі приклади повинні бути миттєво відключені. Заборонено залишати без нагляду включені прилади. У випадку загорання проводки слід негайно вимкнути електрику та погасити вогонь за допомогою вуглекислотного вогнегасника та ковдри з асбесту.

3. Гальмування залізоініційованого окиснення фосфоліпідів

Для оцінки антиоксидантної активності сполук застосовується велика кількість методів і тестових систем [27,33]. При підборі інгібіторів для збереження продуктів харчування, що містять фосфоліпіди (рослинні олії, жири, риба, м'ясо і т.д.), а також при рішенні медичних проблем, зв'язаних з окисненням ліпідів мембран, кращою моделлю є лецитинова ліпосомна емульсія [33]і в біології в якості тестової широко використовується емульсія яєчного жовтка (ЯЖ) [36,39] - гетерогенна система, що містить мембранні структури кліток (при розведенні у фосфатному буфері фосфоліпіди ЯЖ утворюють міцели подвійного шару - ліпосоми), і яка відповідає за ліпідно-білковим складом ліпопротеїнам низкої густини плазми крові [36]. У порівнянні з гомогенатами тканин вона доступна, стабільна при збереженні і, разом з тим, відрізняється високою окиснюваністю, що дозволяє використовувати звичайні лабораторні методики й апаратуру для визначення рівня ПОЛ. Застосування складного природнього субстрату (ЯЖ) утруднює одержання надійних кінетичних даних, але дає можливість якісно оцінити АОА різних сполук.

Загальноприйнятими методами дослідження ПОЛ у даний час є [42] хемілюмінесцентний (ХЛ) і за виміром продуктів пероксидації, таких як дієнові коньюгати, малоновий діальдегид (МДА), гексаналь, пероксиди. На жаль, усі методи не досконалі, тому що мають ряд недоліків. У той же час газоволюмометричний метод вивчення радикально-ланцюгових процесів окиснення (ГВ), який широко використовується на практиці для інших систем, практично не застосовується при дослідженні ПОЛ, очевидно, через низьку чутливість стандартних газоволюмометричних установок. Заміна ртутного нуль-датчика тиску фотоелектронним або чуттєвим елементом тиску дозволили вивчати окисні процеси, що протікають зі швидкістю 10-6 - 10-8 моль * м-1 * с-1.

Окиснення проводилося в умовах близьких до фізіологічних: ~3,3% дисперсія вимороженого яєчного жовтка у фосфатному буфері (рН=7,4, 0,04М КН2РО4/К2НРО4, 0,14М NaCl) t=37?C, [Fe2+]=5·10-3моль/л.

Вплив інкубації на окиснення ЖЛП можна простежити за кінетичними кривими поглинання кисню (рис.3.1).

Рис.3.1 - Вплив умов інкубації яєчного жовтка (1 - без виморожування, 2 - 4 - вимороженого) на процес окиснення його 9 % дисперсії в фосфатному буфері (рН = 7,4; 0,04 М KH2PO4/K2HPO4, 0,14 M NaCl) в присутності [Fe2+] = 2,5*10-3 M.

Тривалість інкубації, година: 2 - 4,5; 1,3 - 24; 4 - 48.

Видно, що для забезпечення помітної швидкості процесу необхідно попереднє (не менш доби) виморожування яєчного жовтка для руйнування природної емульсії й інкубація приготовленої з вимороженого жовтка дисперсії у фосфатному буфері протягом 24 годин.

Інкубація сприяє, ймовірно, нагромадженню деякої кількості пероксидів, що забезпечує початкове ініціювання ланцюгового процесу. Ряд дослідників для цих цілей використовують попереднє УФ - опромінення розчинів [43]. З рис.3.1 також видно, що окиснення ЖЛП йде з невеликим періодом індукції, обумовленим, очевидно, дією ендогенних АО жовтка.

Для вибору оптимальних умов окиснення ЖЛП був вивчений вплив на швидкість процесу температури (рис.3.2), концентрацій субстрату [ЯЖ] (рис.3.3) і ініціатора [Fe2+] (рис.3.4).

Рис.3.2 - Температурна залежність швидкості окиснення 9 % дисперсіі ЖЛП при [Fe2+] = 2,5*10-3 M.

При варіюванні температури було встановлено, що вище 400С швидкість окиснення помітно знижується, а при 500С поглинання кисню відсутнє. Це узгоджується з уявленнями [2] про ферментативний шлях залізоініційованого окиснення біологічних систем. Ферменти, що містяться в них, (НАДФН), що відновлюють ініціатор, інактивуються при підвищених температурах, що і призводить до зниження швидкості окиснення. Оптимальна температура, при якій спостерігається максимальна швидкість окиснення - 370С.

Концентрація субстрату окиснення (рис.3.3) складно впливає на швидкість процесу.

Рис.3.3 - Кінетичні криві поглинання кисню в процесі залізоініційованого окиснення ЯЖ в залежності від масової частки субстрата окиснення; [Fe2+] = 2,5*10-3 M, [ЯЖ], % мас.: 1 - 3,2; 2 - 4,8; 3 - 16,7; 4 - 25,0.

При вмісті в розчині ЯЖ до 1% по масі поглинання кисню не спостерігається, далі швидкість зростає і досягає максимуму при 3,2%. Подальше підвищення концентрації ЖЛП призводить до зниження окиснюваності дисперсії. Це може бути наслідком як збільшення вмісту в системі ендогенних АО, так і підвищення ролі структурного інгібувания і дифузійних процесів при окисненні. Оптимально робоче співвідношення в системі ЯЖ і буфера 1:30. Дослідження впливу парціального тиску кисню в системі на швидкість окиснення при оптимальному вмісті субстрату показала, що зміна тиску в інтервалі 700 мм рт. ст. - 1 атм., як і зміна інтенсивності перемішування, не впливають на швидкість процесу, що свідчить про протікання його в кінетичній області.

Вплив концентрації ініціатора на окиснення дисперсії представлено на рис.3.4. Двовалентне залізо, як відомо [2], виступає ініціатором процесу, але у великих концентраціях може й інгібувати ПОЛ. Отримані результати (рис.3.4) підтверджують це, а максимальна швидкість окиснення досягається при [Fe2+]=5* 10-3моль/л.

Рис.3.4 - Залежність обєму поглиненого кисню при окисненні ЯЖ (3,2 % за масою) при 370С від концентрації ініціатора, t = 15 хв.

Окиснення емульсії яєчного жовтка в оптимальних умовах дозволило одержати в паралельних дослідах відтворені результати за значеннями швидкостей процесу і періодів індукції. Готування розчину й окиснення проводили наступним чином: попередньо виморожений протягом доби яєчний жовток (зберігається при -80С) розводили буфером у співвідношенні 1:30. Після добової інкубації дисперсії проводили окиснення. У нульовому досвіді в реактор поміщали 4,9 мл дисперсії ЯЖ, додавали 0,1 мл 0,025 М водного розчину FeSO4* 7H2O; при дослідженні АОА препаратів уводили 0,1 мл розчину інгібітору необхідної концентрації. Концентрація ініціатора в реакційній суміші була постійною 5* 10-3М.

Окиснення фосфоліпідів у даній системі протікає, як доведено в роботі [2], за вільнорадикальним механізмом. Процес має свої особливості, зв'язані насамперед з тим, що окиснення проходить на границі розділу фаз, процес гетерогенний, ініціатор - метал перемінної валентності, дисперсійне середовище - вода. Ефективність інгібітору повинна залежати від його колоїдної локалізації, розподілу між водною і масляною фазами, взаємодії з поверхнево-активними речовинами емульсії й ініціатором [32]. Незважаючи на велику кількість досліджень, присвячених вивченню антиоксидантних властивостей різних речовин у ліпідних субстратах, дотепер не отримано однозначних даних навіть про поведінку в таких системах іонола. В зв'язку з цим було проведене дослідження антиоксидантної активності типових фенольних антиоксидантів у процесі залізоініційованого окиснення емульсії яєчного жовтка. Необхідно відзначити, що ортополіфеноли, що є найбільш ефективними антиоксидантами неможливо досліджувати на даній модельній системі, тому що вони утворюють комплекси з ініціатором окиснення - двовалентним залізом, тим самим, виводячись із системи. Контроль за процесом окиснення емульсії здійснювали за поглинанням кисню. Вплив на окиснення різних фенольних антиоксидантів оцінювався при однакових концентраціях (10-3моль/л). Отримані кінетичні результати приведені на рис.3.5. Видно, що вивчені сполуки в межах помилки вимірів (±5 хв) практично не впливають на величину періоду індукції окиснення модельної емульсії, обумовленого наявністю ендогенних антиоксидантів.

Вплив уведених добавок позначається на швидкості процесу окиснення після виходу з періоду індукції, що пропорційна об'єму поглиненого кисню. Як критерій антиоксидантної дії фенолів обрана величина (V0-V)/V0, де V0 - об'єм поглиненого кисню емульсією без добавок фенолу через 20 хв після початку окиснення, V - об'єм кисню, поглиненого емульсією, що окиснюється, з добавками фенолу в той же момент часу.

Очевидно, що чим більше відношення (V0-V)/V0, тим ефективніше антиоксидант в обраних умовах гальмує процес окиснення.

З рис.3.5 видно, що феноли в різному ступені гальмують окиснення фосфоліпідів яєчного жовтка, що обумовлено будовою антиоксиданту.

Рис.3.5 - Кінетичні криві поглинання кисню при залізоініційованому окисненні ЯЖ в присутності [InH] = 1*10-3 M:

[InH] = 0

ферулової кислоти

емоксипіна

7-гідрокси - 4-метилкумарина

фенікаберана

арбідола

іонола

Зі збільшенням концентрації уведеного фенолу ступінь гальмування окисного процесу в емульсії яєчного жовтка зростає. Причому вплив концентрації фенолів різний для слабких і сильних антиоксидантів. Так для емоксипіна, що є слабким антиоксидантом (рис.3.6), зниження швидкості окиснення фосфоліпідів спостерігається тільки при досить високих концентраціях (10-3- 10-4 моль/л) і плавно змінюється з ростом концентрації. У той же час іонол (рис.3.7) гальмує процес вже при концентрації в системі 10-5-10-6 моль/л, а подальше збільшення концентрації суттєво не змінює швидкості процесу. Таке розходження в поведінці різних фенольних антиоксидантів виявляється в концентраційній залежності параметра, що характеризує ефективність фенолу у вивченій системі. Для слабких антиоксидантів (рис. 3.8) залежність (V0-V)/V0 від концентрації фенолів лінійна, а для сильних (рис.3.9) має верхню границю.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5